Circular Informativa nº 21A, de 31 de maio de 2020 – COVID19: Diagnóstico Laboratorial (atualização)

Para: Profissionais do Sistema de Saúde
Assunto: COVID-19: Diagnóstico Laboratorial (ATUALIZAÇÃO) Fonte: Direção Regional da Saúde
Contacto na DRS: [email protected]

1. Diagnóstico Laboratorial
   a) O diagnóstico laboratorial do SARS-CoV-2 deve ser aplicado em função dos critérios definidos nas Normas da Direção Regional da Saúde1, nomeadamente, para confirmação de casos de COVID-19, critérios de alta e em circunstâncias particulares definidas pelo médico assistente ou pelas Autoridades de Saúde, avaliadas caso a caso.
   b) O diagnóstico laboratorial será realizado, preferencialmente, em laboratório hospitalar da Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico do SARS- CoV-2, na rede complementar de laboratórios privados ou no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) – laboratório de referência nacional (Apêndice 1);
   c) Os produtos biológicos são enviados ao laboratório o mais rapidamente possível, em ambiente refrigerado (Anexo I), logo após a sua colheita.
   d) A deteção laboratorial de referência do SARS-CoV-2 é feita por RT-PCR em tempo real (rRT- PCR)2.
2. Colheita de Produtos Biológicos
   a) A colheita de produtos biológicos deve ser efetuada por profissionais
   devidamente habilitados para a realização da colheita, conservação e acondicionamento (Anexo II).
   b) Os profissionais de saúde que realizem colheitas de produtos biológicos
   devem cumprir as recomendações de utilização de Equipamento de
   Proteção Individual (EPI) contempladas na CN 29 A, de 13/04/2020 da
   DRS.
   c) Para o diagnóstico laboratorial de SARS-CoV-2 está indicada a colheita
   de produtos biológicos do trato respiratório (superior e/ou inferior, de
   acordo com o contexto clínico), podendo estes ser complementados,
   para fins de estudo e investigação, por colheita de sangue ou de outros
   produtos biológicos (Anexo I).
3. Devem ser colhidos produtos biológicos do:
   3.1. Trato respiratório superior
   a) Exsudado da nasofaringe e exsudado da orofaringe colhido com
   zaragatoa em meio de transporte para vírus. Os dois produtos
   biológicos colhidos com zaragatoa devem ser colocados no mesmo
   tubo, contendo meio de transporte para vírus (2-3 ml) ou, em alternativa,
   em contexto de escassez de meio de transporte, na mesma quantidade
   de soro fisiológico. Deve dar-se prioridade à colheita do exsudado da
   nasofaringe (ou aspirado nasofaríngeo ou lavado nasal) quando não for
   possível a colheita dos dois exsudados.
   b) Em contexto de insuficiência de zaragatoas, a colheita do exsudado da
   orofaringe e da nasofaringe pode ser realizada com a mesma
   zaragatoa.
   3.2. Trato respiratório inferior
   a. Aspirado endotraqueal ou lavado bronco-alveolar, em doentes com doença respiratória grave, sob ventilação mecânica invasiva.
   b. Pode ser colhida expetoração se houver tosse produtiva.
   c. Se analisado apenas um tipo de produto biológico, com resultado
   laboratorial negativo para SARS-CoV-2, em doentes internados e se
   o agravamento da doença o justificar, é recomendada a colheita de
   um segundo produto biológico para o diagnóstico laboratorial.
   Em idade pediátrica deve colher-se um exsudado da nasofaringe (sendo por vezes mais fácil, nestas idades, a colheita de aspirado ou lavado nasal) e uma colheita de exsudado da orofaringe.
4. Os produtos biológicos devem ser colhidos de acordo com as seguintes
   técnicas4:
   a) Exsudado da nasofaringe: Inserir a zaragatoa numa das narinas
   paralelamente ao palato até sentir uma ligeira resistência. Deixar a
   zaragatoa durante alguns segundos para absorção das secreções.
   Remover lentamente com movimento de rotação. Pode repetir a
   colheita na outra narina.
   b) Exsudado da orofaringe: Inserir a zaragatoa na cavidade oral e esfregar
   a parede faríngea e os pilares da orofaringe. Evitar friccionar o palato
   mole ou tocar com a zaragatoa na língua.
   c) Exsudado da orofaringe e da nasofarínge com a mesma zaragatoa:
   Iniciar a colheita pela orofaringe e passar, em seguida, à nasofaringe
   seguindo as instruções anteriores.
5. Os testes serológicos quantitativos poderão suportar a investigação
   dos casos de infeção pelo SARS-CoV-2, revestindo-se da maior
   importância a avaliação e quantificação da presença de anticorpos para
   estudos de imunidade. Neste contexto são necessárias:
   a) Duas amostras de soro, uma primeira da fase aguda da doença e uma
   segunda do período de convalescença (2-4 semanas após o início dos
   sintomas), para a realização de testes serológicos.
6. Em post-mortem, ponderar a colheita de exsudados do trato
   respiratório superior. Se o tubo endotraqueal estiver colocado pode
   também ser colhido um aspirado.
   a) Caso a autópsia seja considerada, colher amostra de tecido da traqueia
   e/ou pulmonar (por incisão ou agulha) e, quando possível, das margens
   dos infiltrados intersticiais e/ou outro tecido ou produto biológico
   considerado relevante.
   b) Caso se verifique a necessidade de proceder a colheita em post-mortem
   ou em situação de autópsia cumprir as recomendações descritas na CN
   nº. 17, de 23/03/2020 da DRS 5.
7. Para assegurar uma boa comunicação com o laboratório, este deve ser
   informado da proveniência dos produtos biológicos. Os produtos biológicos
   devem ser corretamente identificados e acompanhados da notificação do
   SINAVE com a informação relativa ao doente.
8. Condições de Segurança no Acondicionamento e Transporte de
   Produtos Biológicos
   Os profissionais de saúde devem cumprir as regras de prevenção e controlo de infeção aplicáveis, bem como a correta e adequada utilização de EPI, de acordo com a CN da DRS nº. 29A de 13/04/2020.
9. De modo a acondicionar e transportar corretamente os produtos
   biológicos, deve proceder- se da seguinte forma (Anexo II):
   a) Após a colheita dos produtos biológicos, os tubos e recipientes devem
   ser bem vedados;
   b) Os tubos e recipientes devem ser desinfetados exteriormente com
   solução de hipoclorito de sódio, na concentração original de cloro livre
   a 5%, na diluição de 1/50 (1 parte de lixivia em 49 partes iguais de água)
   e de seguida, com álcool a 70%6;
   c) Por fim, a tampa do tubo deve ser selada com película parafilme;
   d) Acondicionar os tubos e recipientes contendo os produtos biológicos,
   seguindo as normas de embalagem de substâncias infeciosas
   recomendadas pela Organização Mundial de Saúde7 para amostras
   classificadas de categoria B (UN 3373);
   e) Utilizar o sistema de embalagem tripla com as seguintes características:
   i. Contentor primário é o que contém o produto biológico; deve estar
   devidamente identificado e tem de ser estanque a líquidos e a
   sólidos; tem de ser embalado em material absorvente suficiente para absorver todo o conteúdo em caso de quebra ou derrame;
   ii. Contentor secundário é o que leva os contentores primários (tubos
   com os produtos biológicos) e deve ser resistente, à prova de água
   e estanque a líquidos e a sólidos; pode conter vários tubos, de
   colheitas diferentes, desde que estes sejam protegidos com material
   absorvente e amortecedor, individualmente e separados, a fim de
   evitar o contacto;
   iii. Contentor exterior é a embalagem de transporte externa com
   material de acolchoamento adequado, onde se coloca o contentor
   secundário. A menor dimensão externa global utilizada deve ser de
   10 x 10 cm.
   f) O transporte dos produtos biológicos deve ser realizado,
   preferencialmente, por uma empresa certificada e autorizada para o
   efeito (Categoria B, UN 3373) ou em alternativa, em transporte próprio
   da unidade de saúde, cumprindo as indicações de acondicionamento
   anteriormente referidas;
   g) O transporte é da responsabilidade da unidade de saúde que realiza a
   colheita dos produtos biológicos, sendo obrigatório a indicação do
   remetente e do destinatário em documento afixado no exterior da
   embalagem.
10. Testes Laboratoriais de Referência
    a) O tratamento dos produtos biológicos e a inativação do RNA viral deve
    ser realizado em laboratório de biossegurança de nível 2 (BSL2) e
    utilizando uma câmara de fluxo laminar de classe II.
    b) O diagnóstico laboratorial de referência do SARS-CoV-2 é realizado
    através de testes de amplificação de ácidos nucleicos, como a reação
    em cadeia da polimerase em tempo real, precedida de transcrição reversa (RT-PCR)8.
    c) Os testes de rRT-PCR para a deteção do SARS-CoV-2 disponíveis
    podem incluir como alvo os genes que codificam para a nucleoproteína
    (N), o invólucro (E), a espícula (S), a RNA dependente RNA polimerase
    (RdRp).
    d) Um caso de COVID-19 considera-se confirmado laboratorialmente
    perante um teste que apresente:
    i. Resultado de rRT-PCR para SARS-CoV-2 positivo para pelo
    menos dois alvos distintos do genoma, dos quais pelo menos um
    específico para SARS-CoV-2 (que distinga dos outros
    coronavírus, incluindo o SARS-CoV-1).
    e) Se surgir um caso com um resultado de inconclusivo ou com um valor
    de ciclo de amplificação do rRT-PCR superior a 35, recomenda-se a
    repetição do teste e/ou da colheita do produto biológico.
    f) Os produtos biológicos que apresentem um resultado analítico duvidoso
    ou que necessitem de análise complementar devem ser enviadas ao
    Laboratório Nacional de Referência para o Vírus da Gripe e outros Vírus
    Respiratórios do Departamento de Doenças Infeciosas, do INSA.
    a. Para além dos controlos internos, para assegurar a qualidade do
    produto biológico (e do processo de diagnóstico molecular), sugere-se,
    sempre que possível, a co-amplificação e deteção de DNA humano no
    produto biológico. A co-deteção de DNA humano no produto biológico
    pressupõe que o RNA viral poderá ser detetado, se presente no
    momento da colheita.
    b. Os laboratórios da Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico do novo coronavírus devem enviar ao INSA uma seleção de amostras positivas para SARS-CoV-2 que representem diferentes momentos da epidemia, grupos etários e áreas geográficas, em número a combinar com o laboratório; e as 5 primeiras amostras negativas para estudo/investigação e avaliação da comparabilidade de resultados.
11. Sequenciação do Genoma Viral9,10
    a) A metodologia de sequenciação de nova geração (NGS) está disponível no
    INSA, para a realização do estudo do genoma do SARS-CoV-2.
    b) Para além da confirmação de casos de infeção pelo SARS-CoV-2, a
    integração da análise genómica do novo coronavírus com a informação
    epidemiológica e clínica dos casos de COVID-19 é crítica para o
    estudo/investigação e controlo da transmissão do vírus na comunidade,
    monitorização da doença e de marcadores genómicos associados à
    gravidade da doença.
    c) O conhecimento do genoma viral permite ainda avaliar o desempenho dos
    testes de diagnóstico laboratorial.
    d) É fortemente recomendada a partilha das sequências virais em bases de dados, como o GISAID, que garantem os direitos de autor e de submissão.
    e) Devem ser enviadas ao Laboratório Nacional de Referência para o Vírus da Gripe e outros Vírus Respiratórios do Departamento de Doenças
    Infeciosas do INSA, para sequenciação do genoma viral, uma seleção de
    amostras positivas de casos de COVID-19 (em número a ser combinado
    com os laboratórios) que representem diferentes momentos da epidemia, grupos etários e áreas geográficas.

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1 https://covid19.azores.gov.pt/
2 WHO (2020). Laboratory Testing for 2019 novel Coronavirus in suspected human cases. WHO. Disponível em:
https://www.who.int/healthtopics/coronavirus/laboratory-diagnostics-for-novel-coronavirus  

3 https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/covid-19-rapid-risk-assessment-coronavirus-disease-2019-eighth-update- 8-april-2020.pdf

4 Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), CDC, 19 março, 2020.

5 Consultar Circular Normativa n.º17, de 23 de março de 2020 – Infeção por SARS-CoV-2 (COVID-19) – Cuidados post mortem, autópsia e casas mortuárias (https://covid19.azores.gov.pt/?page_id=19)

6 Consultar Circular Normativa n.º20/2020, de 23 de março de 2020 – Infeção por SARS-CoV-2 (COVID-19) – Limpeza e
desinfeção de superfícies em estabelecimentos de atendimento ao público ou similares – Infeção por SARS-CoV-2 (COVID- 19) (https://covid19.azores.gov.pt/?page_id=19)
7 WHO (2020). Guidance on regulations for the transport of infectious substances 2019–2020. WHO. Disponível em:
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/325884/WHO-WHE-CPI-2019.20-eng.pdf
IATA (2011). PACKING INSTRUCTION 650. IATA. Disponível em
https://www.iata.org/contentassets/b08040a138dc4442a4f066e6fb99fe2a/dgr-61-en-pi650.pdf

8 World Health Organization (WHO). Laboratory testing for coronavirus disease 2019 (COVID-19) in suspected human cases: Interim guidance – 19 March 2020. Geneva: WHO; 2020 [11 March 2020]. Disponível em: https://www.who.int/publications- detail/laboratory-testing-for-2019- novel-coronavirus-in-suspected-human- cases-20200117

9 ECDC. Novel coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic: increased transmission in the EU/EEA and the UK – sixth update, ECDC, 12 março, 2020. Disponível em: https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/RRA- sixthupdate-Outbreak-of-novel-
coronavirus-disease-2019-COVID-19.pdf
10Plano Nacional de Preparação e Resposta à Doença por novo coronavírus (COVID-19), DGS, 2020. Disponível em:
https://www.dgs.pt/documentos-e-publicacoes/plano-nacional-de-preparacao-e-resposta-para-a-doenca-por- novocoronavirus-covid- 19-pdf.aspx  

Apêndice 1 – Laboratórios com capacidade para diagnóstico laboratorial 
(sujeito a atualização) 

Anexo I 

Acondicionamento de produtos biológicos 

*Em casos pontuais poderá ser acordado a colheita de produtos biológicos complementares 

**Em alternativa, em contexto de escassez de meio de transporte para vírus, pode ser utilizado soro fisiológico na mesma  quantidade 

Anexo: Circular Informativa n.º 21A/2020